產品類別：外周血內皮祖細胞的分離
 
產品編號：VE2012PAP
 
產品名稱：熊貓外周血內皮祖細胞分離液試劑盒
 
產品規格：2X200ml/Kit
 
產品價格：￥1150.00元
 
本品用于分離熊貓外周血內皮祖細胞





“XXXX”動物外周血內皮祖細胞分離液實驗方法
 
 
 
技術文檔編號：TBD0044SOP
 
【產品規格】
 
2×200ml/Kit
 
【產品組成】
 
為方便廣大用戶使用，試劑內容如下：
 

	名稱	產品編號	規格
A	分離液 1		200ml
B	分離液 2		200ml
C	清洗液（贈品）	2010X1118	200ml
D	說明書		1 份

 
【實驗前準備】
 
適用儀器：最大離心力可達 1200g 的水平轉子離心機
 
【檢驗方法】
 
全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃的條件下進行。
 
方法一（需留取血漿備用）
 

• 首先取抗凝血 250g 離心 10min，棄血漿，補加胎牛血清（添加量與棄去血漿量等同）制成細胞懸液，根據細胞懸液液體體積，選擇適當離心管進行試驗。

 

• 取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與細胞懸液體積比為 2：1。如細胞懸液為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量最少不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。

 

• 用吸管小心吸取細胞懸液加于分離液液面上，500g，離心 20-30min（注：根據血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果）。

 

• 離心后，此時離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層。第二層為環狀乳白色內皮祖細胞層（第一層白環及上層 50%分離液 2）。第三層為環狀乳白色單個核細胞層（下層 50%分離液 2 及第二層白環）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細胞層。第六層為紅細胞層。

 

• 用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產品

 

• 250g，離心 10min。

 

• 棄上清。

 

• 用吸管以 5ml 清洗液（產品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

 

• 250g，離心 10min。

 

• 重復 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續實驗所需相應液體重懸細胞。

 
分離圖例：
 
 
 
方法二（不需血漿留存備用）
 

• 根據新鮮抗凝全血樣本量選取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與抗凝血體積比為 2：1。如抗凝血為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量最低不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。
• 用吸管小心吸取抗凝血加于分離液液面上，500g，離心 20-30min（注：根據血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果）。

 

• 離心后，此時離心管中由上至下分為六層。第一層為血漿層。第二層為環狀乳白色內皮祖細胞層（第一層白環及上層 50%分離液 2）。第三層為環狀乳白色單個核細胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細胞層。第六層為紅細胞層。

 

• 后續步驟同方法一。

 
【差異貼壁法純化細胞】
 

（1）用內皮祖細胞無血清培養基（產品編號：TBD20180012）或內皮祖細胞完全培養
 
基（產品編號：TBD20180052）以 1.5-3×10⁶ 個/ml 的密度重懸細胞，將細胞鋪于一次
 
性細胞板或細胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養箱中進行貼壁培養。
 
（2）2-4 小時內貼壁的為巨噬細胞前體（俗稱為單核細胞）。
 
（3）10-24 小時內貼壁的單個核細胞為內皮、內皮祖細胞、干細胞。
 
（4）不貼壁的為淋巴細胞。
 
注：
 

• 無血清培養基中不含任何動物成分，為得到更佳培養效果可添加 10%自體血漿或2-8%經篩選的胎牛血清。

 

• 完全培養基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養的目的細胞而定）。

 

• 由于每種細胞的貼壁時間存在差異可將所得細胞分開已達簡單的純化目的，此法成本相對較低。如需獲得高純度目的細胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選。

 
【注意事項】
 

• 全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得最佳的實驗結果，最好在取血 2h 內進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。

 

• 本實驗最好不使用高聚合材質（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離心管及未經堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。

 

• 吸取過多的內皮祖細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數量增加。

 

• 吸取過多的內皮祖細胞層上層溶液會導致血漿蛋白及血小板混雜。

 

• 分離液用量大于稀釋后的血液樣本時，分離效果更佳。

 

• 如實驗后細胞得率或活性過低，請聯系技術支持以尋求幫助，具體聯系方式詳見下方生產企業信息。

 
【儲存條件及有效期】
 
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】