豚鼠骨髓內皮祖細胞分離液實驗方法 產品編號：VE2012GKG 產品名稱：豚鼠骨髓內皮祖細胞分離液試劑盒 本品用于分離豚鼠骨髓內皮祖細胞 技術文檔編號：TBD0045SOP 【產品規(guī)格】 2×200ml/Kit 【產品組成】 為方便廣大用戶使用，試劑內容如下： 名稱 產品編號 規(guī)格 A 分離液 1 200ml B 分離液 2 200ml C 樣本稀釋液（贈品） 2010C1119 200ml D 清洗液（贈品） 2010X1118 200ml E 勻漿沖洗液（贈品） F2013TBD 200ml F 洗滌液（贈品） TBDTM-W 200ml G 說明書 1 份 【實驗前準備】 1.適用儀器 最大離心力可達 1200g 的水平轉子離心機 2.無菌硅化離心管 序號 產品名稱 產品貨號 規(guī)格 1 無菌硅化離心管/10ml（隨試劑盒附贈 5 支） TUB2015 100 支/包 【骨髓單細胞懸液的制備】 1.以適當方式處死動物，剝離出股骨或脛骨，用剪刀剪斷骨頭兩端，露出內腔。 2.用注射器吸取適量（根據(jù)動物大?。┑膭驖{沖洗液（產品編號：F2013TBD）沖洗出內腔中的骨髓。 3.收集懸液到合適離心管中，反復吹打成單細胞懸液，以 70μm 細胞篩網(wǎng)（產品編號：TBDTM-SC，隨試劑盒附贈 5 個）過濾。 4.450g，離心 10min，棄上清。 5.用樣本稀釋液（產品編號：2010C1119）重懸細胞濃度為 2×108–1×109/ml 的單細胞懸液備用（以小鼠為例，一般使用 1ml 樣本稀釋液重懸骨髓細胞）。 【檢驗方法】 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。 1.取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與細胞懸液體積比為 2：1。如細胞懸液為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量最少不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。 2.用吸管小心吸取細胞懸液加于分離液液面上，500g，離心 20-30min（注：根據(jù)樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果）。 3.離心后，此時離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色內皮祖細胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層（下層 50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細胞層。第六層為紅細胞層。 4.用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 5-10ml 洗滌液（產品編號：TBDTM-W），混勻細胞。 5.400g，離心 10min。 6.棄上清。 7.用吸管以 5-10ml 清洗液（產品編號：2010X1118）重懸所得細胞。 8.250g，離心 10min。 9.重復 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應液體重懸細胞。 分離圖例： 【差異貼壁法純化細胞】 （1）用內皮祖細胞無血清培養(yǎng)基（產品編號：TBD20180012）或內皮祖細胞完全培養(yǎng) 基（產品編號：TBD20180052）以 1.5-3×106 個/ml 的密度重懸細胞，將細胞鋪于一次 性細胞板或細胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)。 （2）2-4 小時內貼壁的為巨噬細胞前體（俗稱為單核細胞）。 （3）10-24 小時內貼壁的單個核細胞為內皮、內皮祖細胞、干細胞。 （4）不貼壁的為淋巴細胞。 注： a)無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。 b)完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細胞而定）。 c)由于每種細胞的貼壁時間存在差異可將所得細胞分開已達簡單的純化目的，此法成本相對較低。如需獲得高純度目的細胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選。 【注意事項】 1.全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得最佳的實驗結果，最好在取樣 2h 內進行實驗，樣品存放時間越長，細胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。 2.本實驗最好不要使用高聚合材質（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。 3.吸取過多的目的細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數(shù)量增加。 4.分離液用量大于骨髓單細胞懸液樣本時，分離效果更佳。 5.如實驗后細胞得率或活性過低，請聯(lián)系天津灝洋技術支持以尋求幫助，具體聯(lián)系方式詳見下方生產企業(yè)信息。 【儲存條件及有效期】 常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結晶，影響分離效果。 【參考值（參考范圍）】 本實驗內皮祖細胞提取率大于 80%。 【相關實驗技術方案】 1.骨髓沖洗單細胞懸液制備技術。 2.所獲得內皮祖細胞的培養(yǎng)技術。 3.所獲得內皮祖細胞的核酸提取技術。 4.所獲得內皮祖細胞的鑒定方法A.流式細胞技術B.免疫組化技術C.原位雜交技術 D.PCR 技術 【可能存在的問題及解決方法】 1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示： 出現(xiàn)情況 出現(xiàn)原因 建議解決方案 離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層 轉速過小或離心時間過短 適當增減轉速 離心后目的細胞存在于分離液中 轉速過大或離心時間過長 離心后白環(huán)層彌散 細胞密度過大 調整細胞密度 離心后白環(huán)層太淺或看不見 細胞密度過小 2.本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當?shù)厍闆r對離心條件進行適當調整。建議對離心條件進行調整時，恒定離心時間，對離心轉速進行調整。 3.本分離液依照國際標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產同類產品略有不同，可 能出現(xiàn)紅細胞沉降不完全的情況，可以適當加大離心轉速。 注：在對離心條件進行調整時，離心轉速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達到最佳分離效果， 離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。